猪伪狂犬病分子诊断方法研究进展

养猪 07月11日

作者/皇甫和平 侯春彬

(郑州牧业工程高等专科学校,河南,郑州,450011)

摘要:伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,Prv)引起的家畜和多种野生动物的急性传染病。分子生物学诊断方法具有快速、敏感、特异等优点,在猪伪狂犬病的诊断中发挥着重要的作用。概述了DNA 酶切图谱分析、核酸杂交、聚合酶链式反应(PCR)和核苷酸序列分析等方法在猪伪狂犬病诊断中应用。

关键词:猪;伪狂犬病;分子生物学;诊断方法;研究进展 

1 概述

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,Prv)引起的家畜和多种野生动物的急性传染病。 Prv由Aujeszky 在 1902 年发现并鉴定,因此,该病又叫奥耶斯基病(Aujeszky's Disease) [1]。20世纪 60 年代以前,伪狂犬病发病并不严重,对养猪业造成的损失不大, 60 年代以后,由于强毒株的出现,伪狂犬病在世界范围内频繁暴发,据报道有 44 个国家和地区发生过该病,有 35 种动物可感染发病。自1948年刘永纯报道猫伪狂犬病以来,我国其它省份陆续有伪狂犬病发生的报道,目前几乎遍及全国。猪伪狂犬病呈现典型的潜伏感染,任何年龄的猪耐过急性感染后,均能形成潜伏感染,病毒在猪体内终生潜伏,一定条件下潜伏的病毒可以激活,引起复发性感染并向外散毒,这种机制导致伪狂犬病很难根除[2]。

快速、准确的诊断方法对伪狂犬病的预防、控制具有十分重要的意义。经过多年的研究,现已建立了多种诊断方法,如动物试验、病毒分离鉴定、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验和乳胶凝集试验等[3]。近年来,随着分子生物学的发展,大大提高了对伪狂犬病的诊断水平,可对病毒基因和结构进行直接检测,常用的分子生物学诊断技术包括 DNA 酶切图谱分析[4-7],核酸杂交[8-14],聚合酶链式反应(PCR)[3,9-10,15-22],核苷酸序列分析[10,23-25] 等。特别是其中的核酸杂交和 PCR 等技术具有特异,快速,敏感,适于早期诊断和潜伏感染的诊断以及大量样品检测等优点,成为本病诊断中最具有应用价值的方法。下面就猪伪狂犬病的分子生物学诊断方法作以简要综述。

2 分子生物学诊断方法

2.1 核酸杂交检测技术

核酸杂交技术是分子生物学的基本技术之一,1968 年由华盛顿卡内基学院的 Roy Britten及其同事发明。其基本原理是当带有互补的特定核苷酸序列的单链 DNA 或RNA混合在一起时,其相应的区段将会退火形成双链的结构。通过特定的方法,已知序列的探针和待检样品中的病毒核酸,会发生杂交,如有杂交信号,则说明样品存在病毒核酸,进而证明病毒感染的存在[4]。

Gurekunst(1979)最早报道应用 RNA-DNA 杂交技术从 Prv 隐性感染猪组织病料中检测出了 Prv-DNA[8]。郭万柱等用P32标记的 Prv基因组 DNA 或克隆片段对病毒DNA和感染猪组织 DNA 进行斑点杂交检出了 10 pg 的病毒 DNA[13]。Linne证实 P32 探针在感染后4小时就可检出组织中 20 pg 的病毒DNA,而分离到病毒则需在 24 -48 h 后[26]。

地高辛探针杂交技术作为一种诊断Prv方法,能够检测到pg级的水平。Maes等用生物素地高辛标记的探针从三叉神经节检出了1 pg Prv DNA,将病料制成切片进行原位杂交,可从单个细胞水平上检出潜伏感染,因为它不但可检出DNA还可检出Prv转录产物[14]。李学伍等所用探针的灵敏度为 2 pg[11]。周复春利用地高辛标记 Prv TK 基因的 953 bp 长的区段制成探针与克隆有 Bam HI 片段的重组质粒杂交,钓出了含 Tk 基因的重组质粒[10]。陈焕春也利用地高辛标记的Prv DNA Bam HI-7 片段作探针与所分离病毒 DNA 进行斑点杂交,出现特异性杂交斑点[11]。与放射性探针检测相比,地高辛标记探针所需同源DNA的含量较高,但地高辛探针性质稳定,-20℃可保存一年以上,操作安全,无需防护,是一种敏感的诊断方法。

魏伟用光敏生物素标记 Prv 特异性糖蛋白 gP50 基因中的 222 bp 片段和重组子pup制备的探针,分别检出了46.8 pg 和 93.6 pg 的 Prv DNA,且pup探针只与 Prv 呈杂交阳性,建立了 Prv 核酸探针检测技术[9]。

2.2 聚合酶链式反应(PCR)

此反应是由 kary.mullis 于1987年发明的。其原理与细胞内发生的 DNA 复制过程十分类似,首先是双链 DNA 分子在临近沸点的温度下加热时会分离成单链的 DNA 分子,然后 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷酸( dNTP )合成新生的互补链[4]。反应有一个特点,在数个小时之内对仅有的几个拷贝基因放大数百万倍,这是该技术广泛应用于病毒检测的最重要原因。

Jestin等从鼻拭子抽提核酸扩增 Prv gD的基因序列,从感染后第一天到第七天,都检出了病毒 DNA ,其中第二、三天含量最高[28]。陈焕春等合成了伪狂犬病毒糖蛋白 gp50 基因引物,对自然发病猪,潜伏感染猪,伪狂犬病毒引起的死胎等 46头猪161个样品进行了扩增, 其中 46头猪71个样品扩增结果为阳性[19]。丁建华等扩增了Prv 湖北地方强毒株的TK基因,琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带在 1.5 kb 左右,表明扩增成功[9]。陈焕春用湖北省某猪场所分离病毒的 DNA 作为模板,以特异性引物通过扩增出伪狂犬病病毒 gp50 基因的 217 bp 长的特异性片段,并利用核酸杂交的方法鉴定[16]。MayrA利用对经过加工处理的食品原料(牛奶,黑香肠,肉馅等)进行 Prv 检测,结果为阳性,表明PCR对样品要求不太严格,是一种可靠的方法[28]。

Balasch等利用 PCR 技术对猪脑脊髓液进行 Prv 的检查,发现该法可检出大部分样品中的 Prv,但对于耐过急性期的猪,感染后 8 周安乐处死,脑脊髓液中检测不到 Prv,这表明对脑脊髓液进行伪狂犬病毒潜伏感染的检测是不充分的[21]。

应用改进的PCR可将 Prv 强弱毒区分开来,Scherba等在 gG 基因上游设计1个通用引物A,再分别根据 gG 基因和Lac基因设计一个下游引物 B和C,对 Prv shope 株(野毒)和 Syntro vet标志疫苗(其基因 gG被Lac基因取代)DNA 进行扩增。结果 A 和B 只能从野毒 DNA 中扩增出特异性片段,引物 A和C 仅能从疫苗毒中扩增出特异性片段。并从感染以上二毒的三叉神经节中检出10个野毒或 10-100 个疫苗毒 DNA 分子[17]。Ishikawa等根据弱毒疫苗株在 gIII 基因上有缺陷,而野毒株上有完整的 gIII 基因设计引物能够从野毒株扩增出特异的 DNA 片段,而疫苗株扩增不出[29]。Katz等针对 gE和Tk 基因分别设计两对引物进行套式PCR,将 Prv 野毒区分开来,可检出 10 pg 的病毒 DNA[18]。Hasebe根据 gD,gE-gI 基因序列设计两对引物,对人工感染 Bartha、Buk以及另外5株野毒的猪组织进行扩增,也能有效地区分开强弱毒[3]。

RT-PCR对细胞中Prv转录、表达的分析同样也可用于Prv的诊断,Taharaguchi等在研究伪狂犬病毒早期基因(EP0)启动子在不同组织里活性的研究中,用 RT-PCR 检测 EP0 基因的 mRNA ,检测到 EP0 基因可在皮肤,肌肉(骨骼肌和心肌),肺,肝,脾,小肠,肾, 脑和睾丸等组织中表达[30]。

2.3  酶切图谱分析

300 kb以下的病毒 DNA 经内切酶水解,进行琼脂糖凝胶电泳后,可观察到清晰的DNA带,据此,人们可以制备准确的病毒基因组核酸酶切图谱。病毒基因组的限制性内切酶图谱,或称物理图谱,是指描绘病毒双链 DNA上各种不同限制性内切酶的酶切位点分布情况,限制性片段大小及其排列顺序的图谱。因此可将分离病毒的酶切图谱与已知内切酶图谱比较,从而对病毒核酸进行鉴定[4]。Lomniczi等对Bartha、Narden等疫苗株及ka等野毒株DNA用BamHI、BglII、KpnI酶切分析,发现弱毒株在US区有缺失[6]。Gielkens等对NIA-3等野毒株和Bartha、Buk、Ercegovac、B-kaL、MK-25五个疫苗株DNA以Bam HI酶切分也证实疫苗株在Us区缺失,导致酶切图谱改变[7]。汪铭书等应用5种限制性核酸内切酶(BamHI, KpnI, SalI, BglII和HindIII)对伪狂犬病毒闽A株DNA酶切,将酶切图谱与Buk株、Shope株、Norden株、S株、台湾Ntu株进行比较,认为闽A株与美国或欧洲毒株无关,而与台湾株同源[5]。

2.4  DNA 核苷酸序列分析

DNA 核苷酸序列分析,是在核酸酶学和生物化学的基础上创立并发展起来的一门重要 DNA 技术。现在测序反应已经标准化,许多生化公司均有测序试剂盒销售及测序服务。

姜焱等对Prv上海株进行PCR扩增。将扩增产物克隆到PGEM-T-easy载体中,进行序列分析,与PRV Rice株的gI基因比较发现,核酸的同原性为91.3%,证实存在gI基因[23]。周复春对Prv鄂A株进行Tk基因的全序列测定,该序列与PRV NiA-3株Tk基因进行比较发现鄂A株的TK基因存在变异[10]。周煜对我国最早分离的伪狂犬病毒Fa株糖蛋白gp63(gI)基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列做了测定与分析,并与Nice株进行了比较,结果显示Fa株gp63基因核苷酸序列与Nice株相比同源性为98.13%,最大差异是Fa株gP63的结构基因开放阅读框架内缺失了3个核苷酸(514-516)[24]。肖少波等对伪狂犬病毒国内地方分离Ea株的gI基因进行序列分析,结果表明gI基因编码区全长1101 bp,与GenBank中收录的国外Rice株的同源比较发现Ea株gI在核苷酸和氨基酸水平上均存在多处突变[25]。潘兹书等对Prv湖北株蛋白激酶基因进行了克隆和序列测定,分析比较了该序列与Prv NIA3株、Ka株以及HSV1、VZVPK基因的同源性[27]。Prv HB株PK与PRV NIA3、PRV Ka、HSV 1、VZV PK基因比较,核苷酸的同源性分别为98.7%、97. 5%、50.7%和42.0%,表明该方法是鉴定Prv基因的准确方法。

2.5 分子免疫技术

Fang等利用基因重组技术得到Prv gE糖蛋白,将纯化的糖蛋白用作乳胶凝集试验抗原,使该乳胶凝集试验更加敏感、简便,并能够进行强弱毒的鉴别诊断[31]。

随着Prv基因工程疫苗的出现,相应鉴别ELISA也问世了。如gE-ELISA,其是由Virschot最早创立的,他应用免疫过氧化物酶单层试验检查猪血清,所有接种gE-株的猪血清抗gE抗体呈阴性,其余血清抗gE抗体是阳性。Jacobs对无伪狂犬病的猪群中的15头gE单因子反应阳性猪进行了PCR和gE-ELISA检测,二者结果一致进一步证明了该方法的可靠性[32],目前已有多种鉴别ELISA方法,如gC-ELISA、gG-ELISA、gE-ELISA等,该方法在强弱毒鉴别方面意义重大,已经并将继续在伪狂犬病的诊断控制方面发挥作用。

此外还有许多分子生物学方法和技术可用于伪狂犬病的诊断。如寡核苷酸指纹图以及生物芯片技术等。这些先进的分子生物学方法具有快速、准确、敏感和特异性强等特点,代表了伪狂犬病等病毒性疾病诊断的发展趋势,且各自有不同的优缺点,适用于不同的检测。但由于技术条件所限,费用较高,现将上述方法用于商业及日常诊断有一定难度,其多数方法仍仅局限于试验室研究应用阶段。

3 小结

综上所述,猪伪狂犬病已经开发了众多的分子生物学诊断方法,这些方法不仅可用于常规的诊断,经过特殊设计,如多重PCR 等还可进行疫苗株和野毒株的区分以及多种疾病的鉴别诊断,随着分子生物学技术的日臻完善,分子生物学诊断方法在猪伪狂犬病的诊断和控制中一定会发挥出更大的作用。

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